安捷倫BioTek分享提高細(xì)胞成像分析成功率下篇

本文轉(zhuǎn)載自安捷倫細(xì)胞分析微信公眾號。

細(xì)胞分析可以提供直觀而豐富的試驗結(jié)果，但是其過程也面臨著諸多的挑戰(zhàn)，回憶一下，當(dāng)你小心翼翼地對你精心呵護(hù)的細(xì)胞完成一系列操作之后，滿懷期待的打開顯微成像系統(tǒng)，對即將呈現(xiàn)在你眼前的美麗又可愛的細(xì)胞倩影滿懷期待的時候，你是否

因為總是找不到細(xì)胞或者焦平面而急躁？

因為剛剛找到的視野又不見了而悔恨？

因為前幾個小時還神采奕奕的細(xì)胞突然就垮了

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6． 選擇合適的聚焦方式

明場自動對焦

圖像自動對焦是自動化成像中最常采用的方法。無標(biāo)記細(xì)胞分析的圖像對焦需要使用明場或相差光路，因為無標(biāo)記的細(xì)胞與背景之間的對比度有限，所以對樣品進(jìn)行適當(dāng)照明很重要。

開始操作時，可以采用手動成像的方式，找到樣本聚焦的 Z 軸高度，并將此值在軟件中該器皿的條件內(nèi)設(shè)定，以便在使用該器皿時，儀器會使用適當(dāng)?shù)拇怪备叨乳_始自動對焦過程，可以最大限度地減少對焦時間。

熒光成像對焦

使用熒光成像方法，可以通過熒光信號實現(xiàn)自動對焦。此種方法在許多情況下都可以提高對焦的簡便性，但在個別情況下需要注意調(diào)整：對于較強的熒光信號，自動聚焦更容易找到合適的焦平面，減少每個樣品的對焦時間；但相反，若是熒光基團(tuán)的信號較弱或背景信號較高則會降低圖像內(nèi)的對比度，并很有可能引起失焦。

在使用具有高數(shù)值孔徑和有限景深的物鏡時，還需要考慮到熒光基團(tuán)在細(xì)胞中的定位。對核染色可以準(zhǔn)備把焦平面定位在核上，但當(dāng)使用第二個通道對位于質(zhì)膜的熒光基團(tuán)所發(fā)出的熒光進(jìn)行成像時，由于這兩個熒光基團(tuán)處于稍有不同的焦平面上，圖像有可能無法正確對焦。使用固定的Z軸偏移可以適應(yīng)這種差異，并且可以容易地校正這種差異。

固定對焦方式

最后，當(dāng)樣品在多個孔或視野的焦平面高度一致性時，或者僅需要對實驗過程或細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行粗略觀察時，可以使用固定對焦代替自動對焦，在盡可能短的處理時間內(nèi)對所有樣品進(jìn)行成像。

7． 圖像采集（曝光）的設(shè)置

圖像采集設(shè)置

合適的圖像采集設(shè)置對于獲得有意義、可量化的數(shù)據(jù)和可用于出版的圖像是至關(guān)重要的。這些設(shè)置通常包括激發(fā)光強度、相機增益和積分時間。定性顯微鏡使用圖像采集設(shè)置，以提供最佳的圖像；定量數(shù)字顯微鏡調(diào)整曝光參數(shù)以便盡可能地利用相機的整個 bit 深度。

避免過度飽和

在一次實驗中對整個孔板進(jìn)行固定曝光成像時，盡可能使用陽性和陰性對照來進(jìn)行曝光設(shè)置，有助于避免像素飽和，同時，持續(xù)曝光可以準(zhǔn)確量化測試樣品之間的熒光變化。由于過曝?zé)o法定量，動態(tài)范圍的上限會被截斷，相反地，如果參數(shù)設(shè)置得太低（通常為了隱藏“背景”熒光），數(shù)據(jù)又會在動態(tài)范圍的下限被截斷，并再次扭曲定量檢測結(jié)果。

手動成像

手動成像也可以用于圖像采集設(shè)置，將得到的最終參數(shù)轉(zhuǎn)移到自動成像的步驟。如果測試孔之間，或樣品對照孔之間的熒光發(fā)生變化，則自動曝光功能就不可使用，因為成像儀會試圖通過相應(yīng)的參數(shù)調(diào)整來補償高/低信號。這將導(dǎo)致數(shù)據(jù)均化，并消除預(yù)期的檢測窗口。如果只有單個樣品需要分析，或者實際信號值之間的比較不是分析標(biāo)準(zhǔn)的一部分，那么自動曝光還是很實用的。

8． 動態(tài)成像

實時追蹤細(xì)胞變化的動態(tài)成像，相比終點法，能夠捕捉到可能會被遺漏的重要細(xì)微差別。動態(tài)成像的另一個好處是通過時間延遲成像獲得動態(tài)的視頻，除了可以進(jìn)行數(shù)值量化以為，還可以可視化預(yù)期的變化。然而，和所有成像實驗一樣，動態(tài)成像也必須遵循一定的指導(dǎo)方針，才能獲得盡可能好的圖像和數(shù)據(jù)。

在動力學(xué)實驗中建議采用固定曝光。因為實驗設(shè)計中盡可能希望量化樣品在孵育期發(fā)生的變化，而采用固定曝光可以防止動態(tài)成像階段的數(shù)據(jù)均化。如果預(yù)期信號值會減少，應(yīng)使用陽性對照進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化；如果預(yù)計信號值會增加，則應(yīng)使用陰性對照。還要注意的是，避免過低的參數(shù)設(shè)置，以免使預(yù)期出現(xiàn)的信號變化超出線性范圍。選用穩(wěn)定的熒光基團(tuán)，保證其在整個成像過程中對光漂白的敏感性較低。

9． 像素的位移

像素偏移是指由于成像路徑中的濾鏡使光線發(fā)生偏移，導(dǎo)致在高分辨率 CCD 相機上檢測到的圖像發(fā)生移位。通常這是由于發(fā)射濾光片的厚度不均造成的，這也被稱為濾光片楔形。在使用不同的熒光通道獲得同一樣品的兩個或多個圖像，然后疊加以同時觀察來自多個熒光基團(tuán)的熒光時，這種偏移就會出現(xiàn)問題。因為每個圖像都會因每一個濾光片組中不同的楔形角度而發(fā)生位移，所以由不同熒光基團(tuán)產(chǎn)生的圖像將無法被準(zhǔn)確地關(guān)聯(lián)或組合起來。

校準(zhǔn)程序（Calibration procedure）

縱使是再昂貴的物鏡和濾光片也依然會存在一定的偏差，可以用校準(zhǔn)程序來進(jìn)行修正。對于自動化的數(shù)字顯微鏡，這一步通常是在 LED 和物鏡校準(zhǔn)時完成的。使用明場作為照明參考，通過測定光圈中心即可測得每組 LED 和物鏡的像素偏移。然后計算出每個像素的像素偏移用來調(diào)整圖像，使多個通道圖像可疊加在適當(dāng)?shù)奈恢谩?/p>

通道轉(zhuǎn)換工具（The channel shift tool）

一些數(shù)字顯微鏡軟件可以在成像后使用通道轉(zhuǎn)換工具來對多色圖像中的單個顏色進(jìn)行重新定位。舉例來講，在單獨的熒光彩色成像步驟中移動的活細(xì)胞樣品，可能會導(dǎo)致重疊圖像與不同顏色發(fā)生輕微錯位。這是由于不同顏色的通道是按順序成像的，而在成像與可捕捉樣品運動之間存在一個很短的時間間隔，通道轉(zhuǎn)換工具使得研究人員可以重新定位通道來進(jìn)行校正。

10． 創(chuàng)造有利的環(huán)境條件

溫度控制

活細(xì)胞的長期動態(tài)成像通常需要對環(huán)境條件進(jìn)行一定程度的控制，以維持樣品的活性。溫度是一個主要考慮因素。雖然大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的生長條件是 37℃ ，但如果要使用細(xì)菌或酵母細(xì)胞，可能需要更高或者更低的溫度。進(jìn)行手動預(yù)設(shè)置或者在實驗程序中添加溫度控制的步驟，可以確保在成像時保持樣本在適當(dāng)?shù)臏囟取?/p>

氣體控制

氣體控制也很關(guān)鍵。例如，使成像倉內(nèi)保持 5% 的二氧化碳濃度，可為哺乳動物細(xì)胞提供合適的氣體環(huán)境。在進(jìn)行低氧誘導(dǎo)時，則需要設(shè)置合適的氧氣濃度。

溫度和氣體控制裝置可以為活細(xì)胞動態(tài)監(jiān)測提供正確的溫度和氣體條件，避免在長時間的動態(tài)成像過程中犧牲樣本的完整性。

如果你現(xiàn)在還沒有找到合適的活細(xì)胞成像平臺，那么你可以了解下安捷倫 BioTek 微孔板成像檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)集多功能微孔板檢測和多功能活細(xì)胞全自動顯微成像于一體。在細(xì)胞增殖，細(xì)胞運動，細(xì)胞遺傳毒性檢測，細(xì)胞免疫反應(yīng)，病毒疫苗研發(fā)，3D 細(xì)胞培養(yǎng)、類器官藥敏檢測以及模式生物如斑馬魚研究方面均有優(yōu)秀的表現(xiàn)。該系統(tǒng)具有成像質(zhì)量高、環(huán)境監(jiān)控嚴(yán)格、自動化操作、高通量智能化分析等特點，可安全、靈活的完成各類基于活細(xì)胞的檢測分析，無論是簡單的細(xì)胞拍攝還是長達(dá)數(shù)周的細(xì)胞培養(yǎng)觀測均能勝任。

僅限研究使用。不可用于診斷目的。

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