安捷倫BioTek分享提高細胞成像分析成功率上篇

本文轉載自安捷倫細胞分析微信公眾號。

細胞分析可以提供直觀而豐富的試驗結果，但是其過程也面臨著諸多的挑戰(zhàn)，回憶一下，當你小心翼翼地對你精心呵護的細胞完成一系列操作之后，滿懷期待的打開顯微成像系統(tǒng)，對即將呈現在你眼前的美麗又可愛的細胞倩影滿懷期待的時候，你是否

因為總是找不到細胞或者焦平面而急躁？

因為剛剛找到的視野又不見了而悔恨？

因為前幾個小時還神采奕奕的細胞突然就垮了而懊惱？

十個提升細胞成像分析成功率的小技巧送給你！

1.樣品制備

高品質的細胞樣品是確保獲得高質量圖像的關鍵一步。

細胞收集

首先，收集細胞前應確認培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)皿中的細胞已達到足夠的密度，注意使用合適的消化液消化細胞，避免影響細胞基本功能。在實驗過程中執(zhí)行嚴格的無菌操作以防止污染，避免外來顆?；蚣毎槠瑢τ绊憟D像質量。

條件優(yōu)化

活細胞成像分析使用的熒光探針需要具有細胞膜透過性，以評估胞內的結構和功能。因此在進行正式實驗之前，需要對熒光探針的濃度和孵育時間進行優(yōu)化，確保孵育后細胞活力不受影響的同時，實驗中仍然能夠檢測到合適的熒光信號強度。此外，還需要注意潛在的背景熒光，針對這一點，可以考慮在成像前加入洗滌步驟。以上這些方法有助于獲得具有良好信噪比的活細胞圖像。

而對于如免疫熒光等固定的細胞分析來講，建議使用經過驗證的固定、透化以及染色方案，包括添加封閉液防止非特異性結合，在必要時優(yōu)化抗體濃度。

2． 耗材使用注意事項

器皿底部厚度

用于顯微鏡觀察的器皿底部厚度很重要，因為倒置顯微鏡是需要透過這個厚度來觀察樣品的。不同耗材有不同的底部厚度，一些常見的耗材底部厚度包括：

Ø玻璃蓋玻片：0.17 mm

Ø常規(guī)塑料微孔板：0.5 mm

Ø低密度微孔板：1.0 mm

專為成像而開發(fā)的新型微孔板，其底部厚度更接近于蓋玻片。當使用較低數值孔徑（NA<0.7）物鏡進行成像時，耗材底部厚度不會產生很大影響。然而，當使用高數值孔徑（NA≥0.8）的空氣鏡時，即便厚度僅有幾微米的變化也會導致圖像降質。且圖像質量會隨耗材厚度的增加而變差。

根據耗材底部厚度調整校正環(huán)

長工作距離物鏡可以兼容不同底部厚度的器皿，來進行活細胞成像觀察。而這類物鏡上會有一個校正環(huán)，通過調節(jié)校正環(huán)的位置就可以調節(jié)物鏡內透鏡組之間的距離，確保了無論使用哪種類型的器皿都能夠精確對焦。所以成像前可以先檢查物鏡校正環(huán)位置是否正確，避免事倍功半。

物鏡校正環(huán)

3． 細胞數量優(yōu)化

對于常規(guī)實驗而言，可分析的細胞數量越多，其結果就越可靠。然而對于細胞成像來說并非如此。細胞接種數量過多，會導致細胞疊加生長，使細胞難以區(qū)分，不利于細胞計數以及進行其他評估。細胞接種數量過少，則會失去統(tǒng)計學意義，還會造成細胞亞群分析的偏離。

實驗的后續(xù)處理和培養(yǎng)過程中細胞的數量的變化也應納入考慮范圍，因為細胞增殖在實驗的準備和進行過程中始終持續(xù)發(fā)生。

4． 細胞類型

應用于成像實驗的細胞類型是多種多樣的，包括永生化細胞系、原代細胞和干細胞等。需要根據細胞類型選擇合適的對焦方式和成像方式。

二維細胞層

在顯微鏡實驗中使用的多數細胞是貼壁細胞或者半貼壁細胞；經過正確的處理，這些細胞會附著在孔板底部并形成二維（2D）細胞層，因為細胞在一個平面上，可利用成像儀的自動聚焦功能實現對焦

懸浮細胞

懸浮細胞，例如紅細胞和白細胞，也可以成像，但此類細胞缺乏附著于表面的能力，需要額外操作將細胞限制在器皿表面，實現單一焦平面聚焦。懸浮細胞成像可以使用帶有蓋玻片的顯微鏡載玻片，或者帶蓋玻片的血細胞計數器上，通過蓋玻片限制細胞在軸向上移動，從而提供更好的圖像清晰度。當使用微孔板時，也可以通過離心將細胞固定至板底。

組織和三維細胞結構

更復雜的生物學研究，需要對組織和三維（3D）細胞結構進行成像分析。和 2D 單層細胞實驗相比，大小和形狀的差異使得組織和 3D 細胞成像需要更先進的成像技術。組織樣品通常會比顯微鏡物鏡提供的視野大得多，尤其是在使用高倍物鏡要求高分辨率的情況下，因此，組織成像可以使用有蒙太奇自動拼接功能，將多視野圖像準確拼接成一張高分辨率大圖用于分析。

3D 細胞結構由成百上千個細胞構成，這些細胞不僅在 X 軸和 Y 軸上延伸，也在 Z 軸上延伸。使用 Z 軸層切成像和疊加可以為具有挑戰(zhàn)性的研究如 3D 細胞、類器官或者有一定厚度的樣本分析提供完全聚焦視圖，同時也增加了后續(xù)分析的準確度。

5． 熒光基團和熒光通道的選擇

激發(fā)和發(fā)射光譜

選擇合適的熒光基團對于成像是至關重要的。熒光探針或蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜應與 LED 光源、激發(fā)和發(fā)射濾光片以及二向色鏡相匹配，以確保獲得滿意的熒光信號。

斯托克斯位移（Stokes shift）

熒光基團的斯托克斯位移是一個需要考慮的重要變量，狹窄的斯托克斯位移會導致背景熒光過度，信噪比降低。所以如果需要多個熒光基團一起使用，則應該進行額外的優(yōu)化。分子光譜往往很寬，激發(fā)和發(fā)射光譜都可能會發(fā)生重疊，導致一個熒光基團滲透到另一個的熒光通道。因此，當兩種熒光基團在細胞內同一區(qū)域做共定位時，這一點要尤為注意。

免責聲明：市場有風險，選擇需謹慎！此文僅供參考，不作買賣依據。

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